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                          凍庫

                          凍庫環境中利用STEM了解鰻魚體液細胞冰晶納米顆粒變化

                            凍庫一般溫度都在-18 ℃以下環境,讓物品冰晶顆粒生成而迅速凍結的方法。物品在凍結過程中會發生各種各樣的變化,如物理變化,細胞組織變化以及生物和微生物變化等。主要用于低溫實驗室、食品、藥品、化工原料的快速冷凍達到保持物理特性和保鮮的目的。以下我們通過科學實驗技術了解鰻魚體液細胞冰晶納米顆粒變化

                            為了進一步了解凍庫中納米粒子在水懸浮液中的行為,需要對納米粒子的分散和表面涂層進行原位表征。用低溫透射電鏡(cryo-TEM)可以分析納米粒子在冷凍、水化狀態下的懸浮狀態,但這種分析往往僅限于成像。這項工作證明了分析掃描透射電子顯微鏡(scanning transmission electron microscopy,STEM)首次用于檢測在玻璃體冰層中捕獲的納米粒子。利用STEM能量色散X射線(EDX)光譜和電子能量損失譜(EELS)對冷凍水合懸浮液在凍庫低溫條件下的成像和分析,證實了CeO 2、Fe2O3、ZnO和Ag納米粒子在懸浮液中的鑒別和分離。在STEM(<2000 e-/O2)中,電子束引起的損傷比CTEM(<100 e-/a2)高得多,這是由于玻璃化冰中產生的輻解產物所造成的擴散有限損傷。對分散在細胞培養介質中的鈦酸鋇生物標志物納米顆粒進行了凍庫低溫分析STEM的進一步應用,觀察了懸浮在介質中納米粒子周圍形成的富Ca和P涂層。這種以前未被報道的涂層在接觸細胞時改變了生物標記物的表面化學。因此,我們表明,這項技術有潛力提高我們對納米粒子在凍庫復雜的水懸浮液中的基本行為的理解。

                          1、凍庫中冰晶納米粒子介紹

                            透射電子顯微鏡(TEM)是納米粒子表征的前沿技術。高分辨率成像可以確定冰晶納米粒子的二維投影尺寸和形狀,光譜分析可以確定冰晶納米粒子的元素組成。使用掃描電鏡(STEM)最常用的方法是實現樣品組成元素的空間映射。

                            結合能量色散X射線(EDX)光譜和電子能量損失譜(EELS).然而,由于透射電鏡的真空要求,在原位或自然狀態分析方面存在局限性,特別是固-液分散和多相互作用的相關研究。

                            為了滿足對分散在凍庫液體中的冰晶納米粒子進行原位表征的需要,最近的發展導致了用于透射電鏡的液體細胞的出現。通過該技術的應用,捕獲了凍庫環境下納米粒子的生長(1)、冰凍結晶(2)和一些生物過程(3)等動態過程。最初的缺點意味著無法完成元素分析或繪圖,Lewis等人已經克服了這些缺點。(4)成功地演示了多組分納米顆粒懸浮液的液體細胞成像和EDX分析。但也有一些局限性:液體細胞分析的主要缺陷是液體懸浮液中產生的束致效應;對于懸浮在水溶液中的樣品,在電子束照射下,水的輻解迅速發生,在入射電子與水分子之間能量傳遞的10 ps范圍內產生水合電子(EH)和OH·、H·和H2·自由基的產物。然后,這些反應物種會發生進一步的反應,產生H2O2、H3O和H2O·(5)的附加損傷產物。在微秒內,這些物種在溶液中擴散并相互反應,并與液體中的周圍分子和粒子發生反應(6)。此外,在沒有競爭過程的情況下,H3O含量的增加可能會導致溶液pH值的下降。雖然這些損壞機制和產品可以用來驅動動態過程(7),但它們對準確描述起始溶液和懸浮產品是非常有害的。即使在相對較低的電子注量(<100 e-/a2)(8)下,也會發生輻照引起的水性懸浮介質的改變。在STEM條件下,在每像素/幀平均通量接近140 e-/(2.s)的條件下,由于懸浮液中產生的輻解產物引起的冰晶納米粒子表面電荷的改變,冰晶納米粒子團簇可以在幾秒鐘內分裂和移出視場。

                            一種替代液體細胞TEM的方法是在<-165 oC(凍庫超低溫技術TEM)的溫度下的制冷設備。一個樣品被涂在TEM的網格上,然后迅速陷入低溫凍庫中,通常是液態乙烷,因此懸浮在一層電子透明的玻璃化冰中被捕獲?焖俨AЩ后w的過程確保了樣品在自然狀態下被捕獲,即不需要懸浮液的再分散或結晶,也不需要水化表面的真空誘導干燥。Cryo-TEM通常與近原子分辨率(10)的生物分子結構的測定有關,但最近已被用于研究有機溶劑(12)中的液晶結構(11)和金納米粒子聚集的有序性。

                            與液體細胞透射電鏡相比,凍庫低溫透射電鏡有很大的好處:首先,玻璃化冰相對于液態水的較低溫度可能導致一些(如果不是全部的話)損傷機制的反應速率降低(13,14)。因此,懸浮液和納米粒子樣品的輻射損傷率可以很好地降低。此外,水的輻解是一個擴散受限的過程(6),在玻璃化溫度(-137 oC)以下的非晶態固體中的擴散速率比在液體(15)慢幾個數量級。玻璃化冰在-165 oC輻射分解過程中產生的反應物(如Eh、OH·、H·、H2·H2O2、H3O和H2O·)的擴散速度比在液態水中緩慢,減少了玻璃化冰(16)的二次損傷。此外,如果懸浮冰在結構上保持完整,粒子的自然分散應該保持不變。例如,該技術(17)報道了分散在細胞培養介質中的納米粒子的團聚,甚至可以解釋(18)納米顆粒團塊的壓扁作用。

                            低溫透射電鏡還去除成分干燥工藝品,以及防止物理運動發生在常規滴鑄TEM樣品制備。我們以前已經證明,在通過常規或冷凍法制備的細胞培養介質中,EDX光譜所提供的納米粒子分散體所提供的元素組成信息有顯著差異(19),F在的要求是提高我們進行低溫分析STEM以獲得空間分辨元素分布的能力。這一領域的研究仍處于起步階段,只有有限的研究使用了這一技術(20,21)。在進行思民凍庫低溫分析STEM時,主要考慮因素仍然是玻璃體冰中的輻解和由此造成的損害。最重要的是,冰會融化,導致納米粒子的移動,在此之前,玻璃化懸浮介質中產生的活性物質可能會改變納米粒子的結構和組成。

                            在這里,我們提出了一項研究,我們最初使用一個測試樣品,其中包括一個簡單的冰晶納米粒子分散在水中,以確定和確定臨界通量,超過這個臨界通量,在常規TEM(CTEM)和STEM成像中都會對玻璃冰造成重大損害,以及注量率對此可能產生的影響。結果表明,與高通量STEM相比,電子束在CTEM中產生的損傷發生在較低的電子流量下,這是由于玻璃化冰中產生的輻解產物的擴散損傷所致。此外,我們還評估了冷凍冰晶STEM EDX和鰻魚光譜的有限靈敏度,以及對晶格成像的空間分辨率的限制。然后,利用分散在細胞培養介質中的鈦酸鋇(BaTiO 3)生物標記納米顆粒體系,展示了襠褲低溫分析STEM對固液界面特征的適用性,以確定源于介質組分的表面涂層。

                          (二)、實驗材料和方法。

                          2.1樣品準備

                            用50μg/ml氧化鐵(Ⅲ)、40 nm(氟卡化學試劑,批號40095/1.22/00)、100μg/ml二氧化鈰、10 nm(聯合研究中心,NM-211)、50μg/ml氧化鋅,制備了去離子水中的多納米顆粒模型懸浮液。一次粒徑20~60 nm(Nanotek,ZH1 121 W CAS#1314-13-2)和20μg/ml金銀核殼,一次粒徑20 nm(Sigma-Aldrich銀分散塊#MKB 19138V),納米顆粒。

                            為研究固體納米粒子與復合多組分液體的相互作用,將鈦酸鋇(BaTiO 3)納米粒子在150℃下水熱合成72 h(22),分散在添加10%胎牛血清(FBS)、1%鏈霉素和青霉素的RPMI培養基中。在去離子水中加入1mg/ml BaTiO 3納米顆粒,在完整的細胞培養基中稀釋至100μg/ml,聲納5h后進行表征。

                            樣品是用FEI維特機器人c(馬克IV)冷凍庫準備的。將一滴3.5μ1的懸浮液置于定量箔透射電鏡柵極(R1.2/1.3;EM分辨率)或萊西碳涂層透射電鏡網格(EM分辨率)上,在印跡力6處涂抹,然后進入液態乙烷。透射電鏡用Gatan 914制冷機,凍庫溫度保持在攝氏-165℃以下,以防止反玻璃化。通過對厚度<200 nm的區域進行分析,發現冰層厚度在網格上是可變的。

                          2.2凍庫低溫透射電鏡

                            使用FEI Tian 3 Themis G2在300 kV下運行,安裝了FEI超級X 4探測器EDX系統、Gatan單視角CCD和Gatan量子965 ER成像濾波器。采用探針電流40~100 Pa(用法拉第杯校準的流感凸輪劑量計測量)、會聚半角8.2Mrad和探針尺寸1.4個小時(用硅片上HAADF圖像分辨率測量)進行冷STEM。Bruker ESPRIT v1.9軟件用于cryo-edX的收集,沒有對任何報告的數據集進行后處理。

                            采用電子損耗近邊緣結構(Elnes)或光譜成像(SI)條件進行冷凍鰻魚實驗.對于Elnes條件,在Gatan顯微鏡套件(V.3.0.1)(GMS)采集軟件中使用了高信號(HI-RES)設置,相當于2.5毫米光譜儀的入口孔徑,不進行綁定。色散為0.25eV/ch,收集角和收斂角分別為21和8.2mrad。為了收集鰻魚的光譜,電子束不斷地發出。

                            掃描整個圖像區域,以了解鰻魚光譜的總曝光時間。模型納米粒子系統采用高損耗漂移管電壓660 eV,曝光60 s,放大115 K倍或230 K倍。對于SI,在GMS軟件中采用5mm光譜儀入口孔徑和130 x垂直聯調的高速(Hi-SNR)設置。采用0.5eV/ch色散,收集角和收斂角分別為11.2和8.2mrad。

                          EELS和EDX光譜均不采用亞像素掃描。

                          2.3電子通量和注量測量

                          2.3.1 [醫][=conventional transmission electron microscope]普通透射電子顯微鏡,常規透射電子顯微鏡

                          電子注量和通量用下列公式計算:

                          𝐸𝑙𝑒𝑐𝑡𝑟𝑜𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑒𝑛𝑐𝑒 (𝑒 −/Å2 ) = 𝑁𝑒 /𝐴

                          𝐸𝑙𝑒𝑐𝑡𝑟𝑜𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑥 (𝑒 −/(Å2. 𝑠)) = 𝑓𝑙𝑢𝑒𝑛𝑐𝑒/𝑡

                            其中Ne是圖像中電子之和,用GMS中的攝像機標定后得到的,A是在O2中的總圖像面積,t是圖像的捕獲長度(S)。另外,Gatan單視角CCD的采集例程允許獲取預先設置的電子注量圖像。

                          2.3.2 scanning transmission electron microscope 掃描透射式電子顯微鏡

                            已經報告了兩種電子通量,在每個像素處接收的局部電子探針通量又被稱為Fp,并且更常見的被稱為Fav的平均電子通量,該平均電子通量是在整個幀上的平均通量。

                          𝐹𝑝 =  𝐼/(𝑒𝐴𝑝 )

                          𝐹𝑎𝑣 = 𝐼/(𝑒𝐴𝑓 )

                            其中I是C/s中的探針電流,e=1.602 x 10-19是C中的電子電荷,AP是直徑為1.4的探針的面積,Af是框架在O2中的總掃描面積。從Fav中可以計算出每次掃描累積的總電子注量乘以t,以s為單位的總掃描時間乘以像素的總停留時間乘以總像素數。

                          𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑎𝑐𝑐𝑢𝑚𝑢𝑙𝑎𝑡𝑒𝑑 𝑓𝑙𝑢𝑒𝑛𝑐𝑒 (𝑒 −/Å2 ) = 𝐼𝑡/(𝑒𝐴𝑓 )

                          3。結果和討論

                          3.1納米顆粒模型懸浮液

                          3.1.1相位對比度冷TEM

                            在低劑量條件下,對<100 e-/a2(電子通量<20e-/(j2.s)圖像進行了總通量小于100 e-/a2(電子通量<20e-/(j2.s)的目標孔徑(21 Mrad)成像,并在特定區域的快速傅立葉變換(Fft)中測量了晶格間距。這些圖像(圖1)。通過對(111)、(002)和(022)晶格面的d-間距分別為3.1、2.7和1.9確定了CeO_2的存在(圖1-A)。由于ZnO和Fe2O3重疊(在實驗不確定范圍內)中某些晶格面的d間距,無法確定其它組分。TEM圖像中兩個區域的d間距測量結果可以與ZnO的(101)晶格面或Fe2O3的(311)晶格面(圖1-C,D)相對應。

                          圖1:模型納米粒子分散在凍庫環境中含CeO 2、ZnO、Fe2O3和Au-Ag核殼納米粒子中的冷凍-CTEM圖像。從每幅圖像中的一個區域得到快速傅里葉變換(FFT)。圖像中的區域(A,黑匣子)給出相應的FFT(B)中可歸因于CeO 2(111)(紅色)、(002)(藍色)和(022)(黃色)和Fe2O3(201)(綠色)的斑點。圖像(C,黑匣子)中的區域給出相應的FFT(D)中可分配給Fe2O3(例如(201)綠色和(211)紅色)或Fe2O3或ZnO(例如藍色Fe2O3(311)或ZnO(101)和黃色(Fe2O3(410)或ZnO(102)的點。

                            圖1中的圖像放大了230 K次,為了防止冰凍融化,必須使用極低強度的電子束(總電子注量<100 e-/a2)。這導致在識別和聚焦所期望的形象方面遇到困難。更高的放大成像需要更高的電子注量才能達到類似的信噪比,這就導致了凍庫中玻璃化冰的快速破壞。

                          3.1.2 Cryo-STEM與cryo-CTEM

                            我們定性地觀察到,在STEM條件下,與CTEM中使用的相同量級的總電子通量/譜對冰的破壞要小得多。在CTEM中暴露于總通量為400 e-/a2且通量為100 e-/(j2.s)的情況下,冰受到嚴重損害,但在STEM中暴露于總電子注量為1000 e-/a2,FP為24x107e-/(j2.s)和Fav為14e-/(a2.s)后,樣品只顯示了冰的輕微損傷(圖2)。在STEM中超過1000 e-/a2的總通量,HAADF圖像中可以檢測到對冰的輕微損傷?偼吭1500~4000 e-/O2之間對冰造成了更大的破壞,但沒有發生總熔化,納米粒子在薄膜中的位置保持不變。相反,在CTEM中電子注量超過400 e-/a2時,對冰和樣品運動有明顯的損傷(圖2(B)。在發生嚴重冰損傷之前,STEM中的總通量可以比CTEM更高,這是一個關鍵的觀測結果,因為對于分析工作來說,較高的通量將確保圖像和EDX/鰻魚光譜中更好的信噪比。然而,嚴格地說,這種比較只應在相同冰層厚度的地區進行,對冰的損害應通過更多的圖像、衍射圖或光譜的定量測量來監測。成像將需要使用BF-STEM和與CTEM的相互作用,由于冰的玻璃體性質,衍射具有挑戰性,但測量低損耗鰻魚曝光后的冰厚變化可能是一種可行的方法。

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                          圖2:暴露于CTEM和STEM中確定電子通量后對玻璃冰的損傷的定性評估。對于CTEM,使用總通量設置捕獲圖像。(A)在100e/Å2時,很少發現損壞,(B)在400e/Å2時,觀察到在黑色箭頭所示的冰中形成氣泡,對冰造成重大損壞。對比HAADFSTEM圖像之前(注量300e/Å2)(C)和(D)將樣品暴露于1000e/Å2的進一步通量后,表明對冰有一定的破壞(在改變對比后插入(D)后,顯示了白色箭頭所示玻璃冰中觀察到的氣泡),但遠遠小于在CTEM較低通量處觀察到的值。

                            很明顯,聚焦STEM探針明顯改變了玻璃體冰凍的整體損傷率。閥桿通常減少樣品的裝藥,從而降低所觀察到的機械應力和試樣運動(23)。此外,盡管樣品的加熱將是極小的,但STEM中的聚焦、高電流密度探頭可能比平行光束引起的加熱更少,盡管這被認為取決于特定探針的直徑和電流;研究表明,超過一定的劑量率,熱加熱可以增加擴散,從而造成更大的損傷(24)。此外,STEM和CTEM在電子通量上的顯著差異也會導致玻璃化冰在一定輻照劑量下的損傷發生變化。提供了一種原理圖(圖3(A),它假定損傷率可能與電子劑量率(或電子通量)(25)相關聯。由于輻射溶解對玻璃化冰(或水)的損傷是擴散性的,在劑量率較高時(即某種形式的冪律依賴關系(指數<1)時,劑量率與損傷率之間存在次線性關系。低劑量CTEM通常使用<10e-/(j2.s)的電子通量進行。相比之下,STEM以極高的局域探針通量工作,對于1.4的探針,其工作順序為108 e-/(2.s)。

                            尺寸和60 Pa探針電流,甚至考慮到光束展寬,這仍然是106 e-/(j2.s)(見下文和圖3(B)。這里應該注意的是,對于STEM,我們指的是探針通量(FP),而不是每幀平均通量(Fav),后者經常被報告,并且可能比局域探針通量低數量級。假設CTEM通量與示意圖和局部STEM探針通量的線性部分對應于劑量率與損傷率曲線穩定的區域,則STEM凍庫中單位通量(即曲線梯度)的損傷將比CTEM低,這與我們所觀察到的情況一致。

                            STEM的進一步考慮因素包括:當聚焦(亞納米)探針穿過試樣時,其展寬;我們用Egerton(26)報告的光束展寬方程估計,在100 nm厚的玻璃化冰中,300 keV電子的束展寬約為0.5 nm(由于冰是非晶態的,因此不會有溝道)(圖3(B)。此外,離STEM探針位置很遠的地方也會有離域損傷,其程度取決于輻射分解所涉及的初級電子激發的能量(因此也取決于這種激發的空間離域)和產物的外擴散和反應活性(27)。水的輻解閾值激發能為7.4eV(28)。由于電子的能量損失與離域距離成反比關系,所以我們可以利用這個閾值(27)來估計電子離域的最大值。在300 kV加速電壓下,最大離域距離在2-6nm之間(圖3(B)?紤]到這些因素,假設玻璃化冰中TG以下對損傷產物的擴散和反應性有很大的限制,我們推測,類似于(29)中對光束敏感材料的EELS SI提出的跳躍掃描方法,通過將STEM中的樣品像素尺寸與加寬探頭周圍的離域損傷距離相匹配,可以將對玻璃化冰損傷的EELS SI降到最小。從而確保冰不被過量取樣。然而,在這種條件下工作的能力將取決于分辨率所需的像素大小和樣品的特定激發能量。在我們正在進行的工作中,要確定在預測的離域損害方面是否存在理想的像素大小,同時使用可比較冰層厚度的區域對STEM和CTEM中的冰的損害進行量化,以便開始確定臨界劑量。

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                          圖3:(A)假設劑量率與損傷率之間的關系的原理圖(25)。我們推測,冰中擴散有限損傷與劑量率之間的冪律關系是指數<1的(示意圖中的紅色曲線)。我們建議CTEM工作在一個較低的通量接近這條曲線的線性部分。相比之下,STEM以較高的每像素通量(即探針通量(FP)工作,因此在思民凍庫中STEM分析的損傷尺度隨著時間的推移比CTEM慢,因此在發現對玻璃體冰的重大損傷之前,STEM凍庫中可能存在更高的累積通量。(B)示意圖(不標度),顯示預計在STEM中將通過100 nm玻璃體冰而產生的光束展寬,以及探頭周圍計算出的最小離域損傷區(以橙色表示)。(C)(B)顯示具有STEM探針大小和估計的離域損傷區域(D)的多個像素的備選視圖(D)?s小像素大小將導致超出成像像素范圍的離域損傷,并且會發生過采樣。

                          3.1.3凍庫低溫閥桿EDX。

                            采用冷凍-STEM-edX分析,證明模型懸浮液中存在各種不同類型的納米粒子。當fp為40x107e-/(j2.s),fv為3e-/(j2.s),3 nm像素大小,停留時間為23μs時,總掃描時間為472s,總電子注量為1300 e-/a2。在這些采集條件下,足夠的元素信號是

                            這使得四種納米粒子中有三種能夠被識別和空間分辨(圖4-A,B,C,D,E)。檢測到與Cu、C(網格)相對應的背景信號,以及Si(被識別為用于初始柵格儲存和在進入冷保持架前將網格保持在液態N2下的網格盒中的污染),以及與Zn、Fe和Ce相對應的清晰X射線信號。為了獲得金銀核殼納米粒子的信號,需要更高的放大倍數(圖4-G)。在較高的放大范圍內,電子注量增加,反玻璃化成為一個問題。為了對抗這種情況,需要更短的掃描時間。在這里,一個額外的EDX掃描在更高的放大率(像素尺寸為0.93 nm)164秒,允許金銀核殼納米粒子被映射。這導致進一步的電子流量9100 e-/a2暴露在圖4(A)中的盒區。然而,玻璃體冰仍然完好無損。為了得到具有代表性的Au圖,采用了特征的Au MαX射線峰,因為Zn Kβ峰(9.572 keV)非常接近Au Lα峰(9.712 keV)。這使得Au更難以獲得足夠的信號,因此,映射不能確定地顯示Au核,但它的存在仍然是通過光譜中檢測到的峰值來確認的。

                            據我們所知,以前還沒有對凍庫-STEM-edX所使用的流場進行過深入的討論。Oleshko等人(30,31)在1998/9年度發表的研究中使用了cryo-edX,但沒有討論電子注量,典型掃描持續了3小時才獲得任何重要信號。最近,沃爾夫等人。(21)用冷凍-STEM-edX法檢測玻璃化細菌中的磷。他們使用的電子通量Fav為16x104e-/(2.s),但沒有引用探針通量(FP)或EDX獲取的總通量。他們在edX繪圖期間對樣品進行了重大破壞,但如果沒有進一步的信息,很難確定這是由于冰受損或被成像的有機細菌的光束敏感性質造成的。

                          凍庫

                          圖4:模型納米粒子系統在100 Pa下收集472 s(1300 e-/O2)的cryo-edX分析證實了CeO 2、Fe2O3和ZnO納米粒子的存在。(A)分析了納米粒子的HAADF STEM圖像;(B)Fe Ka EDX地圖;(C)Zn Ka EDX地圖;(D)該地區的Ce La EDX地圖和(E)EDX譜。(F)Fe Ka(紅色)、Zn Ka(藍色)、Ce La(黃色)和C KA(綠色)綜合EDX地圖。為了證實Ag-Au納米粒子的存在,從(A);(G)HAADF STEM圖像;(H)Ag Lα(橙色)和Au Mα(白色)EDX地圖和(I)區域EDX圖譜中收集了第二個cryo-edX數據集。采用MαAu信號而不是Lα信號來避免Zn Kβ信號的干擾。

                          3.1.4低溫閥桿EELS。

                            EELS可以在CTEM中的干燥樣品上進行,但沒有明顯的空間分辨率(在衍射模式下),但我們已經表明,即使在相對較低的電子通量下,CTEM也會對玻璃體冰造成嚴重的破壞。另外,鰻魚可以使用STEM進行操作,為了保存玻璃體冰,我們必須調整典型的SI設置參數,用于干燥樣品。這是因為典型的SI掃描使用30s的像素駐留時間,1.3nm的像素大小和60 Pa的束流將產生108個e-/a2量級的總電子注量。我們已經指出,在STEM中超過4000 e-/a2的通量會對玻璃體冰造成損害。因此,我們建立了兩種方法,其中鰻魚可以在玻璃體標本上進行STEM。首先,如果很少或不需要空間分辨率,那么在低溫條件下,光束可以連續掃描到整個視場,停留時間為5s,因為分光計收集能量信號(在整個掃描區域上平均),其總曝光量通常小于60s。在此條件下,總電子注量可達到3000 e-/a2量級(圖5)。利用該收集裝置,我們成功地從模型納米粒子體系中識別出鐵、鈰和鋅在低溫條件下的損耗邊緣。其次,如果需要高空間分辨率的元素映射,則可以使用替代的捕獲參數(詳見2.2節),這將導致Elnes的損失,但保留足夠的信號從光譜映射元素。這項工作已在第3.2節中進行。冷凍-鰻魚以前已經進行過,但這一直只使用低損耗(LL)鰻魚(32-34)。由于探測器的前向定位,EELS是一種比EDX更有效的技術。然而,幾乎所有的信號都來自前向散射的零損耗電子,只有很小一部分來自非彈性散射的電子,這些電子會產生核心損耗邊。以往工作中使用的典型電子注量范圍為25-1000 e-/a2(34),部分原因是需要防止對使用中的束敏感軟物質樣品造成損害,而且LL鰻魚需要比芯損鰻魚更短的曝光時間和較低的注量水平。

                            足夠的電子計數。在這里,我們已經第一次展示了在低溫條件下進行巖心損耗鰻魚的可能性(圖5和圖7)。

                          凍庫

                          圖5:多納米顆粒懸浮液的冷鰻魚.(A)采用0.25eV/ch色散,2.5mm入口孔徑,660 eV HL漂移管,暴露60 s,225 kx停留時間5s,獲得了背景減冷鰻魚光譜?傠娮幼⒘繛2000 e-/O2。708 eV處的FeL2,3白線邊證實了Fe_2O_3納米粒子的存在,CeM_4,5邊在883-901 eV處證實了CeO_2的存在,而Zn L3邊在1020 eV處證實了ZnO納米粒子的存在。未獲得Au或Ag邊。(B)分析了該地區的Cryo-HAADF STEM圖像。

                          低溫分析STEM在固-液相互作用捕獲中的應用

                          建立了玻璃體切片中STEM/EDX和EELS的基本方案,并將此技術應用于分散在細胞培養介質中的鈦酸鋇(BaTiO 3)納米粒子的懸浮液中。BaTiO 3納米粒子在醫學領域有著廣泛的應用,如醫學成像和基因傳遞(35)。因此,對BaTiO 3的治療效益和任何潛在的細胞毒性的細胞攝取研究都是以納米粒子最初分散在細胞培養基(36,37)中進行的。這種復雜的水溶液含有一系列無機鹽、維生素和氨基酸,經常補充FBS,其中含有有助于細胞生長的蛋白質。然而,當納米粒子分散在細胞培養基(38,39)中時,已知存在顯著的生物-納米相互作用。因此,我們有興趣應用凍庫低溫環境分析STEM來研究BaTiO 3納米粒子與復雜介質之間的生物納米界面,試圖了解納米粒子在更相關的體外/體內條件下的行為。

                            在我們之前的工作中,我們已經確定了在分散在凍庫細胞培養介質中的鈦酸鋇納米粒子周圍形成的富含鈣和磷的涂層(19)。這被認為是通過延伸浴超聲制備樣品的人造制品。此外,也許更重要的是,我們發現干燥的人造制品發生在傳統的凍庫制冷過程中,導致大量鹽在納米粒子周圍積累。冷凍樣品顯示,在溶液中,所有的鹽都保持溶解在鈣和磷的來源,聚集在納米粒子周圍。如果不通過適當的超聲處理,這種涂層將改變納米粒子暴露在細胞中的表面化學,可能影響攝取和毒性。

                            用總電子注量1800 e-/a2、探針電流60 Pa和2 nm像素大小繪制的莖-edX圖譜顯示了先前觀察到的BaTiO 3納米粒子周圍形成的涂層(圖6)。Na和Cl均為細胞培養基的組成成分,EDX圖譜顯示Na完全分散在懸浮液中。在細胞培養中也發現Mg,EDX譜中也有類似的觀察,但Mg EDX圖譜表明Mg可能存在于BaTiO 3納米粒子周圍的涂層中。眾所周知,Mg2可以替代磷酸鈣化合物中的Ca~(2+),我們認為這可能發生在這里。

                          圖6:分散在CCCM中的BaTiO 3的cryo-edX地圖。探針電流為60 Pa,停留時間為23μ,總掃描時間為251 s?傠娮幼⒘繛2000 e-/O2。(A)HAADF STEM圖像顯示懸浮液中納米粒子周圍有一層涂層。EDX圖譜證實納米粒子中存在(B)Ba和(C)Ti,并確定涂層為(D)P,(E)Ca,(G)Mg含量較低。(H)Na是媒體的組成部分。(F)

                          包覆Ba La,Ti Ka,P Ka和Ca KA的X圖譜。

                            為了嘗試并獲得有關鈣磷沉淀形式的更多信息,執行STEMEELS。獲得CaL2,3邊,但PL2,3邊被從90eV的BaN4,5邊緣延伸的特征遮蔽。PL2,3的檢測。

                          凍庫

                          邊界因難以擬合背景而變得復雜,根據以前的工作,使用了一階對數多項式背景(40)。

                            BaTiO_3在EDX分析中的一個問題是在4.465(Lα)和4.508(Kα)keV分別用于元素量化和映射時很難解決(或解譯)Ba和Ti信號。冷凍條件下的Si鰻魚能夠分離Ba和Ti信號(圖7)。圖7所示掃描的總電子注量為2000 e-/a2,使用40 Pa探針電流和10 nm像素大小。還可以看到一個清晰的Ca2,3邊緣,其空間位置映射到納米粒子周圍的涂層位置。用130 eV的低損耗漂移管電壓來獲得PL2,3邊緣,而不需要進行廣泛的后處理,但這還沒有成功。

                          圖7:在低溫凍庫下拍攝的鰻魚光譜圖像-使用探針電流為40 Pa、像素大小為10 nm和像素停留時間為0.08s的條件下,總的通量為2000 e-/a2。(A)分析粒子的HAADF STEM圖像;(B)Ba M4,5 MAP;(C)Ti L2,3 MAP;(D)分析區域的鰻魚光譜;(E)分析后的HAADF STEM圖像;(F)Ca L2,3 MAP;(G)Ba M4,5(紅色),Ti L2,3(藍色)和Ca L2,3(黃色)的組合圖。Ca圖譜在空間上分解了納米粒子周圍的涂層。532 eV處的大O K邊緣是由于樣品周圍的玻璃化冰造成的。掃描前和掃描后的兩張STEM圖像顯示,玻璃體冰層保持足夠完整,顆粒能夠保持原狀,但在富鈣涂層及其周圍出現了一些損傷效應。

                            在這項工作中使用的電子通量遠高于生物學研究中典型的電子通量。生物冷TEM成像通常采用小于10e-/a2的低電子注量進行。這不僅是為了維持玻璃化冰,也是為了處理光束敏感的有機軟質物質。相比較而言,BaTiO 3是一種致密的納米材料,不會受到明顯的光束損傷,因此能夠承受光譜分析所需的更高通量。高通量的STEM探針比CTEM更好地超越了由冰輻解產物引起的擴散損傷,這為探索STEM和CTEM開辟了機會。

                          凍庫

                          特別是冷凍水合懸浮液的相對比STEM,如聚合物涂層,甚至有機物和藥品(41,42)。

                            我們已經證明,冰晶納米粒子在凍庫復雜生物流體中的固液相互作用可以通過冷凍水分散體的冷分析STEM來識別和分析。STEM探針的高通量率使其能夠在流場中獲得良好的信噪比譜(EDX和EELS),對玻璃化冰的損傷最小,而包裹的納米粒子由于在冰中明顯的擴散有限損傷機制而沒有明顯的運動。這使我們能夠識別和理解納米粒子在復雜介質中的行為,特別是監測表面涂層的任何變化。這將有助于促進納米醫學和納米毒理學領域的持續發展。

                          4. 結束( conclusion的名詞復數 )

                          凍庫環境中利用STEM分析是一個強有力的工具,通過它可以對凍結的玻璃狀懸浮液中的納米粒子進行精確的自然元素分析。它使電子注量可達2000 e-/O2,而不會對玻璃化冰基質造成重大損害。這比低溫凍庫中-CTEM成像(通常在<100 e-/a2時進行)要高,因為損傷率與擴散有限的玻璃體冰損傷引起的劑量率呈非線性關系。這是一個重要的發現,考慮到總電子注量的增加是通過STEM EDX/鰻魚光譜獲得納米級元素地圖的關鍵。通過對納米粒子周圍一層富鈣、富磷涂層的鑒定,用冷分析STEM方法研究了BaTiO 3納米粒子與完整細胞培養物組分的表面相互作用。這可能會影響生物標記物在細胞中的表面化學,當然也證明了這項技術的范圍和意義。冷凍分析STEM將提供遠比分析真空干燥樣品更相關的信息,并將繼續提高我們對懸浮納米粒子的基本行為的理解,深入了解了凍庫溫度下的鰻魚體液細胞的變化,達到根據不同產品提供特定的凍庫試驗環境。


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